氨基酸不能發生雙縮脲反應。與雙縮脲試劑反應的實際上是肽鍵，而氨基酸沒有肽鍵，只有兩個以上氨基酸在相互縮合形成多肽時才會生成肽鍵。氨基酸是含有堿性氨基和酸性羧基的有機化合物，是羧酸碳原子上的氫原子被氨基取代后形成的化合物。
雙縮脲反應是肽和蛋白質所特有的，而為氨基酸所沒有的一種顏色反應。一般分子中含有兩個氨基甲酪基的化合物與堿性溶液作用，生成紫色或者藍紫色的絡合物。由于蛋白質分子中含有很多與雙縮脲結構相似的肽鍵，因此也能與銅離子在堿性溶液中發生雙縮脲反應，且顏色深淺與蛋白質的含量的關系在一定范圍內符合比爾定律，而與蛋白質的氨基酸組成及分子量無關，故可用雙縮脲法測定蛋白質的含量。
雙縮脲反應主要涉及肽鍵，因此受蛋白質特異性影響較小。且使用試劑價廉易得，操作簡便，可測定的范圍為1～10mg蛋白質，適于精度要求不太高的蛋白質含量的測定，能測出的蛋白質含量須在約0.5mg以上。雙縮脲法的缺點是精確度低、所需樣品量大。干擾此測定的物質包括在性質上是氨基酸或肽的緩沖液，如TrIs緩沖液，因為它們產生陽性呈色反應，銅離子也容易被還原，有時出現紅色沉淀。